Приветствую!
Продолжаем наш блог «Хроматография от А до Я». В предыдущей серии мы уделили внимание газовой хроматографии, поэтому теперь предлагаю перейти к жидкостной.
Если вы работаете с фармацевтическими препаратами, биологическими образцами, пищевыми продуктами или сложными многокомпонентными смесями, то, вероятнее всего, периодически сталкиваетесь с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
Этот метод применяется для разделения компонентов сложных смесей, их идентификации и количественного определения. Метод позволяет определять как целевые компоненты, в частности действующие вещества, так и сопутствующие примеси и продукты деградации.
ВЭЖХ и газовая хроматография: в чем разница
Оба метода работают по одному принципу – нам нужно разделить смесь на отдельные компоненты, а затем понять, что именно содержится в образце и в каком количестве. Но если в газовой хроматографии подвижной фазой является газ и вещество нужно перевести в газообразное состояние, то в ВЭЖХ подвижная фаза – жидкость, а анализ осуществляется в потоке элюента.
Именно поэтому жидкостная хроматография хорошо подходит для веществ, которые сложно или вообще невозможно анализировать методом ГХ: биомолекул, белков, витаминов, фармацевтических препаратов и многих других нелетучих, термолабильных или сложных для анализа методом ГХ соединений.
А теперь разберемся, что происходит внутри ВЭЖХ-системы после того, как мы поставили виалу с образцом и запустили анализ.
Как происходит разделение
Образец вводится в поток подвижной фазы – растворителя или смеси растворителей – и вместе с ней попадает в колонку.
Внутри колонки находится сорбент, то есть стационарная фаза. Компоненты пробы взаимодействуют со стационарной фазой по-разному: одни удерживаются сильнее, другие слабее. Поэтому выходят из колонки в разное время. Далее они попадают в детектор, а мы видим результат в виде пиков на хроматограмме.
Звучит достаточно просто. На самом деле то, получим ли мы два хорошо разделенных пика или одно непонятное пятно на хроматограмме, зависит от состава подвижной фазы, колонки, температуры, скорости потока, режима работы насоса, объема инъекции и еще многих параметров. К ним мы вернемся в следующих частях. Сначала пройдемся по самой системе.
Из чего состоит ВЭЖХ-система
Начнем с насоса. Именно он подает подвижную фазу через систему и поддерживает заданный поток. В ВЭЖХ жидкость проходит через плотно заполненную колонку, поэтому работа происходит под высоким давлением. Для результата важна, прежде всего, стабильность: если поток начинает изменяться, вместе с ним могут смещаться и времена содержания компонентов.
Далее – ввод пробы. Он может быть ручным или автоматическим.
Для ручного ввода используют инжекционный кран и шприц. Такой вариант вполне подходит, когда проб немного. Но чем больше серия, тем ощутимее становится влияние оператора: нужно каждый раз воспроизвести тот же объем и правильно провести инъекцию.
Поэтому для серийной работы обычно используют автосамплер. Мы загружаем виалы, задаем последовательность – и система сама отбирает и вводит пробы. Особенно удобно, когда анализ длительный: хроматограф может продолжать работу без постоянного участия оператора.
После ввода проба попадает в колонку. И вот здесь происходит то, ради чего мы, собственно, и запускаем хроматограф, – разделение компонентов.
Рядом с колонкой работает термостат. Температура для ВЭЖХ важна: ее изменение может влиять на содержание веществ и, соответственно, на само разделение. Поэтому для воспроизводимой работы условия должны оставаться стабильными от анализа к анализу.
На выходе из колонки установлен детектор. Самый распространенный вариант – УФ- / Vis-детектор, который регистрирует поглощение света веществами. Но есть еще флуоресцентные, рефрактометрические, масс-спектрометрические и другие детекторы. Здесь все зависит от того, что мы анализируем.
И завершает систему программное обеспечение. Оно собирает сигнал, строит хроматограмму, позволяет работать с пиками и проводить количественный анализ.
То есть ВЭЖХ – это не отдельный «прибор с колонкой», а последовательная система, где каждый блок влияет на следующий.
Что мы видим на хроматограмме
Когда анализ завершен, перед нами появляется хроматограмма. И здесь есть три базовых вещи, которые следует понимать с самого начала.
Первая – время удержания, или retention time. Это время от момента ввода пробы до появления соответствующего пика. В одинаковых условиях анализа оно помогает нам идентифицировать компоненты образца.
Вторая – сам пик: его высота и площадь. Для количественного анализа нас особенно интересует площадь пика, поскольку она связана с количеством вещества в пробе.
И третье – разрешение. Если два компонента выходят из колонки почти одновременно, то их пики начинают накладываться. А это уже усложняет идентификацию и количественное определение. Потому хорошая хроматограмма – это не просто много пиков, а пики, которые мы можем нормально разделить и интерпретировать.
Рекомендуемое оборудование
Есть два бренда высокоэффективных жидкостных хроматографов, о которых я хотела бы сказать отдельно.
О первом мы уже говорили в разделе о газовой хроматографии, Young In Chromass. Это южнокорейский производитель, работающий в сфере хроматографии и масс-спектрометрии уже около 30 лет. Компания производит газовые и жидкостные хроматографы, масс-спектрометры и другое лабораторное оборудование.
ВЭЖХ-системы ChroZen HPLC следует рассматривать как современные модульные решения для рутинных и исследовательских задач. Система может комплектоваться разными насосами, автосамплерами и детекторами, поэтому конфигурацию можно подобрать в соответствии с конкретной методикой и потребностями лаборатории.
Второй бренд, который я хотела бы назвать, – немецкий KNAUER, имеющий более чем 60 лет опыта в производстве оборудования для жидкостной хроматографии. Оборудование KNAUER разрабатывается и производится в Германии, а компания остается семейным бизнесом с головным офисом в Берлине.
Системы KNAUER AZURA особенно интересны своей модульностью и широкими возможностями конфигурации. Для них доступен большой выбор насосов, систем ввода проб, детекторов и других модулей, что позволяет адаптировать систему под различные аналитические задачи и при необходимости расширять ее возможности в будущем.
Отдельно следует упомянуть препаративную хроматографию. KNAUER имеет широкую линейку AZURA Prep HPLC – от компактных систем для полупрепаративной очистки до лабораторных и пилотных систем для масштабирования процессов.
Еще одна интересная особенность KNAUER – специальная AZURA Educational HPLC System, разработанная именно для обучения принципам жидкостной хроматографии в учебных заведениях.
Поэтому оба бренда имеют свое место в лаборатории. Выбор между ними, как и выбор самой ВЭЖХ-системы, стоит делать не только по техническим характеристикам, но прежде всего исходя из конкретных аналитических задач, необходимой конфигурации и перспектив дальнейшего развития лаборатории.
В следующей части предлагаю подробнее пройтись по пути подвижной фазы: чем отличаются изократический и градиентный режимы, для чего контролировать pH, зачем дегазировать растворители и какую роль во всем этом играет колонка.
Полезные ссылки
ХЛР стал официальным дистрибьютором YOUNG IN Chromass в Украине
Газовый хроматограф Chrozen GC от YOUNGIN Chromass
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии
Еще больше современных решений для ВЭЖХ: ХЛР стал официальным дистрибьютором KNAUER GmbH
Анастасия Рябченко,
team-lead отдела аналитического оборудования направления «Хроматография»