Вітаю!
Продовжуємо наш блог «Хроматографія від А до Я». У попередній серії ми приділили увагу газовій хроматографії, тож тепер пропоную перейти до рідинної.
Якщо ви працюєте з фармацевтичними препаратами, біологічними зразками, харчовими продуктами або складними багатокомпонентними сумішами, то, найімовірніше, періодично стикаєтеся з високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ).
Цей метод застосовується для розділення компонентів складних сумішей, їх ідентифікації та кількісного визначення. Метод дає змогу визначати як цільові компоненти, зокрема діючі речовини, так і супутні домішки й продукти деградації.
ВЕРХ і газова хроматографія: у чому різниця
Обидва методи працюють за одним принципом – нам потрібно розділити суміш на окремі компоненти, а потім зрозуміти, що саме міститься в зразку й у якій кількості. Але якщо в газовій хроматографії рухомою фазою є газ і речовину потрібно перевести в газоподібний стан, то у ВЕРХ рухома фаза – рідина, а аналіз здійснюється в потоці елюенту.
Саме тому рідинна хроматографія добре підходить для речовин, які складно або взагалі неможливо аналізувати методом ГХ: біомолекул, білків, вітамінів, фармацевтичних препаратів та багатьох інших нелетких, термолабільних або складних для аналізу методом ГХ сполук.
А тепер розберімося, що відбувається всередині ВЕРХ-системи після того, як ми поставили віалу зі зразком і запустили аналіз.
Як відбувається розділення
Зразок вводиться у потік рухомої фази – розчинника або суміші розчинників – і разом з нею потрапляє в колонку.
Усередині колонки є сорбент, тобто стаціонарна фаза. Компоненти проби взаємодіють зі стаціонарною фазою по-різному: одні утримуються сильніше, інші – слабше. Тому виходять із колонки в різний час. Далі вони потрапляють до детектора, а ми бачимо результат у вигляді піків на хроматограмі.
Звучить досить просто. Насправді те, чи отримаємо ми два добре розділені піки, чи одну незрозумілу пляму на хроматограмі, залежить від складу рухомої фази, колонки, температури, швидкості потоку, режиму роботи насоса, об’єму ін’єкції та ще багатьох параметрів. До них ми повернемося в наступних частинах. Спершу пройдемося по самій системі.
Із чого складається ВЕРХ-система
Почнемо з насоса. Саме він подає рухому фазу через систему та підтримує заданий потік. У ВЕРХ рідина проходить через щільно заповнену колонку, тому робота відбувається під високим тиском. Для результату важлива передусім стабільність: якщо потік починає змінюватися, разом з ним можуть зміщуватися й часи утримання компонентів.
Далі – введення проби. Воно може бути ручним або автоматичним.
Для ручного введення використовують інжекційний кран і шприц. Такий варіант цілком підходить, коли проб небагато. Але чим більша серія, тим відчутнішим стає вплив оператора: потрібно щоразу відтворити той самий об’єм і правильно провести ін’єкцію.
Тому для серійної роботи зазвичай використовують автосамплер. Ми завантажуємо віали, задаємо послідовність – і система сама відбирає та вводить проби. Особливо зручно, коли аналіз тривалий: хроматограф може продовжувати роботу без постійної участі оператора.
Після введення проба потрапляє до колонки. І ось тут відбувається те, заради чого ми, власне, і запускаємо хроматограф, – розділення компонентів.
Поруч із колонкою працює термостат. Температура для ВЕРХ важлива: її зміна може впливати на утримання речовин і, відповідно, на саме розділення. Тому для відтворюваної роботи умови мають залишатися стабільними від аналізу до аналізу.
На виході з колонки встановлено детектор. Найпоширеніший варіант – УФ- / Vis-детектор, який реєструє поглинання світла речовинами. Але є ще флуоресцентні, рефрактометричні, мас-спектрометричні та інші детектори. Тут усе залежить від того, що саме ми аналізуємо.
І завершує систему програмне забезпечення. Воно збирає сигнал, будує хроматограму, дає змогу працювати з піками та проводити кількісний аналіз.
Тобто ВЕРХ – це не окремий «прилад із колонкою», а послідовна система, де кожен блок впливає на наступний.
Що ми бачимо на хроматограмі
Коли аналіз завершено, перед нами з’являється хроматограма. І тут є три базові речі, які варто розуміти із самого початку.
Перша – час утримання, або retention time. Це час від моменту введення проби до появи відповідного піка. За однакових умов аналізу він допомагає нам ідентифікувати компоненти зразка.
Друга – сам пік: його висота й площа. Для кількісного аналізу нас особливо цікавить площа піка, оскільки вона пов’язана з кількістю речовини у пробі.
І третя – роздільна здатність. Якщо два компоненти виходять з колонки майже одночасно, їхні піки починають накладатися. А це вже ускладнює ідентифікацію та кількісне визначення. Тому гарна хроматограма – це не просто багато піків, а піки, які ми можемо нормально розділити й інтерпретувати.
Обладнання, яке я рекомендую
Є два бренди високоефективних рідинних хроматографів, про які я хотіла б сказати окремо.
Про перший ми вже говорили в розділі про газову хроматографію, Young In Chromass. Це південнокорейський виробник, який працює у сфері хроматографії та мас-спектрометрії вже майже 30 років. Компанія виробляє газові й рідинні хроматографи, мас-спектрометри та інше лабораторне обладнання.
ВЕРХ-системи ChroZen HPLC варто розглядати як сучасні модульні рішення для рутинних і дослідницьких завдань. Система може комплектуватися різними насосами, автосамплерами й детекторами, тому конфігурацію можна підібрати відповідно до конкретної методики та потреб лабораторії.
Другий бренд, який я хотіла б назвати, – німецький KNAUER, що має понад 60 років досвіду у виробництві обладнання для рідинної хроматографії. Обладнання KNAUER розробляється й виготовляється в Німеччині, а компанія залишається сімейним бізнесом з головним офісом у Берліні.
Системи KNAUER AZURA особливо цікаві своєю модульністю й широкими можливостями конфігурації. Для них доступний великий вибір насосів, систем введення проб, детекторів та інших модулів, що дає змогу адаптувати систему під різні аналітичні задачі й за потреби розширювати її можливості в майбутньому.
Окремо варто згадати препаративну хроматографію. KNAUER має широку лінійку AZURA Prep HPLC – від компактних систем для напівпрепаративного очищення до лабораторних і пілотних систем для масштабування процесів.
Ще одна цікава особливість KNAUER – спеціальна AZURA Educational HPLC System, розроблена саме для навчання принципів рідинної хроматографії в закладах освіти.
Тому обидва бренди мають своє місце в лабораторії. Вибір між ними, як і вибір самої ВЕРХ-системи, варто робити не лише за технічними характеристиками, а насамперед виходячи з конкретних аналітичних задач, необхідної конфігурації та перспектив подальшого розвитку лабораторії.
У наступній частині пропоную детальніше пройтися шляхом рухомої фази: чим відрізняються ізократичний і градієнтний режими, для чого контролювати pH, навіщо дегазувати розчинники і яку роль у всьому цьому відіграє колонка.
Корисні посилання
ХЛР став офіційним дистриб’ютором YOUNG IN Chromass в Україні
Газовий хроматограф Chrozen GC від YOUNGIN Chromass
Метод високоефективної рідинної хроматографії
Ще більше сучасних рішень для ВЕРХ: ХЛР став офіційним дистриб’ютором KNAUER GmbH
Анастасія Рябченко,
team-lead відділу аналітичного обладнання напряму «Хроматографія»