Приветствую!
В статье «Жидкостная хроматография: основы работы с ВЭЖХ. Часть 1» мы разобрали общий принцип ВЭЖХ и прошлись по основным блокам системы. Теперь хочу более подробно остановиться на том, как происходит разделение компонентов и какие параметры влияют на результат анализа. Но сначала кратко расскажу об оборудовании, которое рекомендую рассмотреть для работы с ВЭЖХ.
ВЭЖХ-системы для разных задач лаборатории
Среди производителей жидкостных хроматографов хочу выделить два бренда, предлагающих модульные системы для разных аналитических задач.
Первый – южнокорейский Young In Chromass, о котором мы уже говорили в главе о газовой хроматографии. Его системы ChroZen HPLC позволяют подобрать насосы, автосамплеры и детекторы в соответствии с конкретными потребностями лаборатории.
Второй – немецкий KNAUER с более чем 60-летним опытом. Его системы AZURA также отличаются модульностью и возможностью расширения конфигурации. Кроме аналитических систем, производитель имеет линейку AZURA Prep HPLC для препаративной хроматографии и AZURA Educational HPLC для лабораторий.
Оба бренда предлагают гибкие решения, поэтому выбор конкретной системы зависит прежде всего от аналитических задач и потребностей лаборатории. Однако даже правильно подобранное оборудование – лишь часть успешного анализа. Не менее важно понимать, как управлять самим процессом разделения. Ведь результат зависит от состава подвижной фазы, ее подачи через систему и изменения условий при анализе. Поэтому начнем с двух основных режимов элюирования в ВЭЖХ – изократического и градиентного.
Изократический или градиентный режим
В случае изократического элюирования состав подвижной фазы на протяжении всего анализа остается неизменным. К примеру, мы приготовили смесь воды и ацетонитрила 60:40. В таком соотношении она будет проходить через колонку от первой до последней минуты анализа. Это довольно простой и понятный режим, хорошо работающий, если компоненты смеси обладают близкими свойствами и нормально разделяются при одних условиях. Но далеко не все пробы столь удобны.
Иногда часть веществ выходит из колонки быстро, а другая настолько сильно удерживается, что анализ может длиться очень долго. В таком случае используют градиент: состав подвижной фазы изменяется непосредственно во время анализа. К примеру, начинаем с большего количества воды, а затем постепенно увеличиваем долю органического растворителя. За счет этого можно работать со более сложными смесями и в пределах одного метода разделять компоненты, существенно отличающиеся по свойствам. Если совсем просто: изократика – неизменные условия в течение анализа, градиент – условия постепенно меняем.
Состав подвижной фазы
Чаще всего в ВЭЖХ работают с водой, ацетонитрилом и метанолом в разных соотношениях. И здесь важно не воспринимать подвижную фазу просто как жидкость, переносящую пробу от насоса к детектору. От ее состава напрямую зависит, как долго компоненты будут удерживаться в колонке и насколько хорошо они разделятся.
Отдельная тема – рН. Если мы работаем с соединениями, способными ионизироваться, изменение pH может заметно изменить их поведение в колонке. Поэтому водную часть движущейся фазы часто готовят в виде буферного раствора. Его задача – поддерживать стабильное значение pH. Это важно именно для воспроизводимости. Если сегодня мы приготовили подвижную фазу с одним pH, а завтра получили несколько иное значение, время удержания компонентов тоже может измениться. А потом начинается знакомая ситуация: метод тот же, колонка та же, но пики почему-то «поехали». Поэтому приготовление подвижной фазы – далеко не второстепенный этап.
Дегазация подвижной фазы
Растворенные в движущейся фазе газы могут образовывать пузырьки. А пузырьки в ВЭЖХ нам не нужны: они могут оказывать влияние на стабильность работы насоса и детектора. Вот поэтому растворители дегазируют. Для этого применяют ультразвук, вакуумную дегазацию или встроенные дегазаторы. В современной системе оператор часто даже не думает об этом процессе, потому что дегазатор работает автоматически. Но роль этого маленького модуля лучше не недооценивать.
Роль колонки в ВЭЖХ
Если насос отвечает за движение движущейся фазы, то именно колонка – за самое главное, разделение компонентов. Снаружи ВЭЖХ-колонка смотрится достаточно просто: металлическая трубка с фитингами на концах. Но внутри находится то, ради чего она, собственно, и нужна – слой сорбента или стационарной фазы. Когда проба попадает в колонку, ее составляющие начинают взаимодействовать со стационарной фазой. Именно здесь и происходит разделение.
Подбор колонки
Правильный выбор колонки имеет большое значение для решения конкретной аналитической задачи и обеспечения эффективного и селективного разделения компонентов. Колонки отличаются типом сорбента, его химическими свойствами, размером частиц, геометрией колонки и другими параметрами. Даже если две колонки имеют одинаковый формат и схожее название, результаты на них могут отличаться. Например, для обратно-фазовой хроматографии широко распространены колонки с неполярной стационарной фазой C18. Однако важно отметить, что выбор типа сорбента, размера частиц, пористости и других характеристик будут влиять на полученный результат хроматографического анализа.
Поэтому выбор колонки – вопрос не просто размера или цены. Прежде всего, нужно понимать, что именно мы хотим разделить.
Длина и внутренний диаметр колонки непосредственно влияют на работу метода. Например, более длинная колонка обычно обеспечивает более эффективное разделение, но анализ при этом может длиться дольше. Меньшие частицы сорбента могут повышать эффективность разделения, но одновременно увеличивают сопротивление потоку и соответственно требования к насосу.
Итак, колонка – один из ключевых элементов ВЭЖХ-системы, в значительной степени определяющий качество разделения, правильно подобранная колонка помогает получить четкое разделение компонентов, приемлемую продолжительность анализа и стабильную работу системы.
А теперь, когда мы разобрались с подвижной фазой и колонкой, пора поговорить о том, как увидеть компоненты после их разделения. Переходим к детектору.
Выбор детектора для ВЭЖХ
Самым распространенным для ВЭЖХ остается УФ- / Vis-детектирование. Принцип достаточно прост: вещество проходит через проточную ячейку, а детектор измеряет поглощение света на заданной длине волны. Для большого количества органических соединений этого достаточно.
Если требуется более высокая чувствительность и вещество имеет соответствующие свойства, можно использовать флуоресцентный детектор. Он особенно полезен для определения очень низких концентраций.
Еще один вариант – RID или рефрактометрический детектор. Он регистрирует изменение показателя преломления и может использоваться для веществ, которые сложно определять по УФ-поглощению. Но здесь важно ограничение: такой детектор не подходит для градиентного режима, поскольку сам состав подвижной фазы постоянно меняется.
И, конечно, ВЭЖХ можно совмещать с масс-спектрометрией. В этом случае мы получаем гораздо больше информации о компоненте, но и сама система и работа с ней становятся сложнее. Потому, как и с колонкой, детектор нужно подбирать не по принципу «чем дороже, тем лучше», а под конкретную аналитическую задачу.
От чего зависит качество разделения
В жидкостной хроматографии сложно рассматривать насос, подвижную фазу, колонку или детектор по отдельности. Изменили состав элюента – изменилось содержание. Изменили pH – изменилось поведение части веществ. Поставили другую колонку – получили другую селективность. Выбрали неподходящий детектор – отлично разделили компонент, но нормально его не зарегистрировали. Именно поэтому разработка ВЭЖХ-метода всегда состоит из работы сразу с несколькими параметрами.
А в следующей, третьей, части перейдем к ситуациям, с которыми сталкиваются уже во время ежедневной работы: как правильно вводить пробу, почему может «плыть» базовая линия, откуда берутся двойные пики, что делать с изменением давления и как ухаживать за системой после завершения анализов.
Полезные ссылки
ХЛР стал официальным дистрибьютором YOUNG IN Chromass в Украине
Газовый хроматограф Chrozen GC от YOUNGIN Chromass
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии
Еще больше современных решений для ВЭЖХ: ХЛР стал официальным дистрибьютором KNAUER GmbH
Анастасия Рябченко,
team-lead отдела аналитического оборудования направления «Хроматография»