Вітаю!
У статті «Рідинна хроматографія: основи роботи з ВЕРХ. Частина 1» ми розібрали загальний принцип ВЕРХ і пройшлися основними блоками системи. Тепер хочу детальніше зупинитися на тому, як відбувається розділення компонентів і які параметри впливають на результат аналізу. Але спочатку коротко розповім про обладнання, яке рекомендую розглянути для роботи з ВЕРХ.
ВЕРХ-системи для різних завдань лабораторії
Серед виробників рідинних хроматографів хочу виділити два бренди, які пропонують модульні системи для різних аналітичних завдань.
Перший – південнокорейський Young In Chromass, про який ми вже говорили в розділі про газову хроматографію. Його системи ChroZen HPLC дають змогу підібрати насоси, автосамплери й детектори відповідно до конкретних потреб лабораторії.
Другий – німецький KNAUER з понад 60-річним досвідом. Його системи AZURA також вирізняються модульністю й можливістю розширення конфігурації. Окрім аналітичних систем, виробник має лінійку AZURA Prep HPLC для препаративної хроматографії та AZURA Educational HPLC для навчальних лабораторій.
Обидва бренди пропонують гнучкі рішення, тому вибір конкретної системи залежить насамперед від аналітичних завдань і потреб лабораторії. Однак навіть правильно підібране обладнання – лише частина успішного аналізу. Не менш важливо розуміти, як керувати самим процесом розділення. Адже результат залежить від складу рухомої фази, її подавання через систему й зміни умов під час аналізу. Тому почнемо з двох основних режимів елюювання у ВЕРХ – ізократичного та градієнтного.
Ізократичний чи градієнтний режим
У випадку ізократичного елюювання склад рухомої фази протягом усього аналізу залишається незмінним. Наприклад, ми приготували суміш води й ацетонітрилу 60:40. У такому співвідношенні вона і проходитиме через колонку від першої до останньої хвилини аналізу. Це досить простий та зрозумілий режим, який добре працює, якщо компоненти суміші мають близькі властивості й нормально розділяються за одних умов. Але далеко не всі проби настільки зручні.
Іноді частина речовин виходить із колонки швидко, а інша настільки сильно утримується, що аналіз може тривати дуже довго. У такому випадку використовують градієнт: склад рухомої фази змінюється безпосередньо під час аналізу. Наприклад, починаємо з більшої кількості води, а потім поступово збільшуємо частку органічного розчинника. За рахунок цього можна працювати зі складнішими сумішами й у межах одного методу розділяти компоненти, які суттєво відрізняються за властивостями. Якщо зовсім просто: ізократика – незмінні умови протягом аналізу, градієнт – умови поступово змінюємо.
Склад рухомої фази
Найчастіше у ВЕРХ працюють із водою, ацетонітрилом і метанолом у різних співвідношеннях. І тут важливо не сприймати рухому фазу просто як рідину, яка переносить пробу від насоса до детектора. Від її складу безпосередньо залежить, як довго компоненти будуть утримуватися в колонці й наскільки добре вони розділяться.
Окрема тема – pH. Якщо ми працюємо зі сполуками, здатними іонізуватися, зміна pH може помітно змінити їхню поведінку в колонці. Тому водну частину рухомої фази часто готують у вигляді буферного розчину. Його завдання – підтримувати стабільне значення pH. Це важливо саме для відтворюваності. Якщо сьогодні ми приготували рухому фазу з одним pH, а завтра отримали трохи інше значення, час утримання компонентів теж може змінитися. А потім починається знайома ситуація: метод той самий, колонка та сама, але піки чомусь «поїхали». Тому приготування рухомої фази – далеко не другорядний етап.
Дегазація рухомої фази
Розчинені в рухомій фазі гази можуть утворювати бульбашки. А бульбашки у ВЕРХ нам не потрібні: вони можуть впливати на стабільність роботи насоса й детектора. Саме тому розчинники дегазують. Для цього застосовують ультразвук, вакуумну дегазацію або вбудовані дегазатори. У сучасній системі оператор часто навіть не думає про цей процес, тому що дегазатор працює автоматично. Але роль цього невеликого модуля краще не недооцінювати.
Роль колонки у ВЕРХ
Якщо насос відповідає за рух рухомої фази, то саме колонка – за найголовніше, розділення компонентів. Зовні ВЕРХ-колонка досить проста: металева трубка з фітингами на кінцях. Але всередині її те, заради чого вона, власне, і потрібна, – шар сорбенту, або стаціонарної фази. Коли проба потрапляє в колонку, її компоненти починають взаємодіяти зі стаціонарною фазою. Саме тут і відбувається розділення.
Підбір колонки
Правильний вибір колонки має велике значення для вирішення конкретної аналітичної задачі та забезпечення ефективного й селективного розділення компонентів. Колонки відрізняються типом сорбенту, його хімічними властивостями, розміром частинок, геометрією колонки та іншими параметрами. Навіть якщо дві колонки мають однаковий формат і схожу назву, результати на них можуть відрізнятися. Наприклад, для обернено-фазової хроматографії дуже поширені колонки з неполярною стаціонарною фазою C18. Однак важливо зазначити, що саме вибір типу сорбенту, розміру частинок, пористості й інших характеристик будуть впливати на отриманий результат хроматографічного аналізу. Тому вибір колонки – питання не просто розміру або ціни. Насамперед потрібно розуміти, що саме ми хочемо розділити.
Довжина та внутрішній діаметр колонки безпосередньо впливають на роботу методу. Наприклад, довша колонка зазвичай забезпечує ефективніше розділення, але аналіз при цьому може тривати довше. Менші частинки сорбенту можуть підвищувати ефективність розділення, але водночас збільшують опір потоку і, відповідно, вимоги до насоса. Отже, колонка – один із ключових елементів ВЕРХ-системи, який значною мірою визначає якість розділення, правильно підібрана колонка допомагає отримати чітке розділення компонентів, прийнятну тривалість аналізу й стабільну роботу системи.
А тепер, коли ми розібралися з рухомою фазою та колонкою, час поговорити про те, як побачити компоненти після їх розділення. Переходимо до детектора.
Вибір детектора для ВЕРХ
Найпоширенішим для ВЕРХ залишається УФ- / Vis-детектування. Принцип досить простий: речовина проходить через проточну комірку, а детектор вимірює поглинання світла на заданій довжині хвилі. Для великої кількості органічних сполук цього цілком достатньо.
Якщо потрібна вища чутливість і речовина має відповідні властивості, можна використовувати флуоресцентний детектор. Він особливо корисний для визначення дуже низьких концентрацій.
Ще один варіант – RID, або рефрактометричний детектор. Він реєструє зміну показника заломлення й може використовуватися для речовин, які складно визначати за УФ-поглинанням. Але тут є важливе обмеження: такий детектор не підходить для градієнтного режиму, оскільки сам склад рухомої фази постійно змінюється.
І, звичайно, ВЕРХ можна поєднувати з мас-спектрометрією. У цьому випадку ми отримуємо значно більше інформації про компонент, але й сама система та робота з нею стають складнішими. Тому, як і з колонкою, детектор потрібно підбирати не за принципом «чим дорожчий, тим краще», а під конкретну аналітичну задачу.
Від чого залежить якість розділення
У рідинній хроматографії складно розглядати насос, рухому фазу, колонку або детектор окремо. Змінили склад елюенту – змінилося утримання. Змінили pH – змінилася поведінка частини речовин. Поставили іншу колонку – отримали іншу селективність. Обрали невідповідний детектор – чудово розділили компонент, але нормально його не зареєстрували. Саме тому розроблення ВЕРХ-методу завжди складається з роботи одразу з кількома параметрами.
А в наступній, третій, частині перейдемо до ситуацій, з якими стикаються вже під час щоденної роботи: як правильно вводити пробу, чому може «плисти» базова лінія, звідки беруться подвійні піки, що робити зі зміною тиску і як доглядати за системою після завершення аналізів.
Корисні посилання
ХЛР став офіційним дистриб’ютором YOUNG IN Chromass в Україні
Газовий хроматограф Chrozen GC від YOUNGIN Chromass
Метод високоефективної рідинної хроматографії
Ще більше сучасних рішень для ВЕРХ: ХЛР став офіційним дистриб’ютором KNAUER GmbH
Анастасія Рябченко,
team-lead відділу аналітичного обладнання напряму «Хроматографія»