Химические методы определения активности ферментов

Суть метода заключается в использовании специфических химических реактивов для обнаружения активных ферментов в молоке после его пастеризации. Присутствие ферментов указывает на недостаточную пастеризацию или добавление в пастеризованное молоко «сырого».

Преимущества:

1. Использование качественных методов не требует специального дорогостоящего оборудования.
2. Способы регламентируются нормативными документами.
3. Нет нужды в пробоподготовке.

Фотометрический метод (ISO/TS 17193 | IDF/RM 208:2011 - Milk - Determination of the lactoperoxidase activity - Photometric method (Reference method), не регламентируется в Украине).

Суть метода: для выявления активности пероксидазы применяется специфический реагент ABTS (2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота), диаммонийная соль), который, при наличии активного фермента, изменяет свой цвет, измеряемый фотометрически при длине волны 420 нм.

1. Реакция с солянокислым парафенилендиамином (1,4-фенилендиамин) – качественное исследование.

При расщеплении пероксида водорода пероксидазой образуется кислород, окисляющий парафенилендиамин с образованием синей окраски. Время исследования – 5 – 10 минут. Наличие фермента выявляют по изменению окраски молока (синий цвет) в пробирке.

2. Реакция с йодистокалиевым крахмалом – качественная реакция.

В пробирку к 3 – 5 мл исследуемого молока добавить 3 – 5 капель раствора калия йодида крахмала и 1 – 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода. Вращающимися движениями перемешайте содержимое пробирки после добавления каждого реактива. Появление интенсивной синей окраски крахмала указывает на наличие пероксидазы в молоке. Время исследования – 5 мин.

1.  Фенольный метод (ISO 3356:2009, в Украине не регламентируется).

Суть метода: заключается в высвобождении из фенилфосфата натрия под действием щелочной фосфатазы фенола, который взаимодействует с хинонидом с образованием цветного соединения, которое определяют фотометрически при волне 610 нм.

Преимущества:

1. Метод признается европейскими производителями.
2. Количественное определение активности фермента.

2. Флюорометрический метод ((ДСТУ ISO 11816-1:2016. Молоко та молочні продукти. Визначення активності лужної фосфатази. Частина 1. Флюорометричний метод для молока та молочних напоїв).

Суть метода: заключается в использовании специфического реагента «Флуорофоса», который в присутствии щелочной фосфатазы приобретает флуоресцентные свойства.

Преимущества:

1. Относительно быстрый способ определения активности щелочной фосфатазы.

1. Реакция с 4-аминоантипирином – качественная реакция.

При наличии активного фермента происходит гидролиз соли фенилфосфорной кислоты с образованием фенола, который дает розовую окраску с 4-аминоантипирином. Чувствительность метода позволяет выявить добавление непастеризованных продуктов в следующих количествах: 0,3% в молоке, сливках, кисломолочных продуктах; 0,5% в твороге и сметане; 1% в кисломолочных продуктах с немолочными компонентами. Приблизительное время проведения анализа 1 – 1,5 часа.

Метод определения активности кислой фосфатазы подобен методу определения щелочной фосфатазы по реакции с 4-аминоантипирином, но при рН 4,0. В случае присутствия активного фермента исследуемый продукт приобретает окраску от светло-розовой до темно-вишневой. Время проведения исследования составляет 2,5 – 3 часа.