Хімічні методи визначення активності ферментів

Використання ряду сполук для визначення активності ферментної системи молока для контролю температурного режиму. ДСТУ 7380:2013 Молоко та молочні продукти. Методи визначення наявності пероксидази й фосфатази (лужної та кислої).

ДСТУ 7380:2013 Молоко та молочні продукти. Методи визначення наявності пероксидази й фосфатази (лужної та кислої).

Суть методу полягає у використанні специфічних хімічних реактивів для виявлення активних ферментів у молоці після його пастеризації. Присутність ферментів вказує на недостатню пастеризацію, або на додавання у пастеризоване молоко «сирого».

Переваги:

  1. Використання якісних методів не потребує спеціального дороговартісного обладнання.
  2. Методи регламентуються нормативними документами.
  3. Не потребують пробопідготовки.

Особливості:

  1. Постановка методики доволі тривала і пов’язана із використанням хімічних реактивів.
  2. Більшість методів дозволяє виявити лише якісну присутність у молоці активних ферментів (є/немає).
  3. Потребують періодичної підготовки робочих розчинів для проведення аналізу.

Необхідне обладнання: ваги лабораторні, водяна баня, плитка електрична, рН-метр, термостат та комплект реактивів у залежності від методу.

Методи визначення пероксидази

Кількісний метод

Фотометричний метод (ISO/TS 17193 | IDF/RM 208:2011 - Milk - Determination of the lactoperoxidase activity - Photometric method (Reference method), не регламентується в Україні).

Суть методу: для виявлення активності пероксидази застосовується специфічний реагент ABTS (2,2′-азино-біс(3-етилбензотіазолін-6-сульфонова кислота), діамонійна сіль), який, за наявності активного ферменту, змінює свій колір, який вимірюють фотометрично при довжині хвилі 420 нм.

Необхідне обладнання: аналітичні ваги, рН-метр, спектрофотометр, водяна баня, піпетки, посуд лабораторний.

Із реактивів: буферний розчин із рН 6,0, розчин пероксиду водню, розчин діамонійної солі 2,2-азино-біс(3-етилбензотіазолін-6-сульфонової кислоти) [C18H16N4O6S4(NH4)2].

Якісні методи

1. Реакція з солянокислим парафенілендіаміном (1,4-фенілендіамін) – якісне дослідження .

При розщепленні пероксиду водню пероксидазою утворюється кисень, який окислює парафенілендіамін із утворенням синього забарвлення. Час дослідження – 5 – 10 хвилин. Наявність ферменту виявляють по зміні забарвлення молока (синій колір) у пробірці.

2. Реакція з йодистокалієвим крохмалем – якісна реакція.

В пробірку до 3 – 5 мл досліджуваного молока додати 3 – 5 крапель розчину калій йодиду крохмалю і 1 – 2 краплі 1%-ного розчину перекису водню. Обертальними рухами перемішати вміст пробірки після додавання кожного реактиву. Поява інтенсивного синього забарвлення крохмалю вказує на наявність пероксидази в молоці. Час дослідження – 5 хв.

Методи визначення лужної фосфатази

Кількісні методи

1. Фенольний метод (ISO 3356:2009, в Україні не регламентується).

Суть методу: полягає у вивільненні із фенілфосфату натрію під дією лужної фосфатази фенолу, який взаємодіє із хінонімідом з утворенням кольорової сполуки, яку визначають фотометрично при хвилі 610 нм.

Переваги:

  1. Метод визнається європейськими виробниками.
  2. Кількісне визначення активності ферменту.

Особливості:

  1. Тривалий по часу метод визначення.
  2. Потребує значної кількості реактивів та обладнання.

Необхідне обладнання та реактиви: водяна баня, спектрофотометр, електрична плитка, гідроксид натрію і барію, борна кислота, метаборат натрію, хлорид натрію, дегідратдвонатрієвийфенілфосфат, сульфат цинку, сульфат міді, розчин Гібса, фенол.

2. Флюорометричний метод (ДСТУ ISO 11816-1:2016. Молоко та молочні продукти. Визначення активності лужної фосфатази. Частина 1. Флюорометричний метод для молока та молочних напоїв).

Суть методу: полягає у використанні специфічного реагенту «Флуорофоса», який у присутності лужної фосфатази набуває флуоресцентних властивостей.

Переваги:

  1. Відносно швидкий метод визначення активності лужної фосфатази.

Особливості:

  1. Для проведення дослідження необхідні специфічні реактиви та обладнання компанії Advanced Instruments, Inc.
  2. Потрібне додаткове обладнання.

Необхідне обладнання та реактиви: проточний флюориметр (Advanced Instruments, Inc), інкубаційний блок для кювет, водяна баня та реактиви «Флуорофос».

Якісні методи

1. Реакція з 4-аміноантипірином – якісна реакція.

У разі присутності активного ферменту відбувається гідроліз солі фенілфосфорної кислоти з утворенням фенолу, який дає рожеве забарвлення із 4-аміноантипірином. Чутливість методу дозволяє виявити додавання непастеризованих продуктів в наступних кількостях: 0,3% в молоці, вершках, кисломолочних продуктах; 0,5% в сирі і сметані; 1% в кисломолочних продуктах з немолочними компонентами. Приблизний час проведення аналізу 1 – 1,5 години.

2. Реакція із фенолфталеїнфосфатом натрію – якісна реакція

Фосфатаза гідролізує фенолфталеїнфосфат натрію до фенолфталеїну, який у лужному середовищі набуває рожевого кольору. Час проведення дослідження – 1 година. При наявності лужної фосфатази в молоці та молочних продуктах вміст пробірки набуває забарвлення від світло-рожевого до яскраво-рожевого.

Визначення кислої фосфатази

Метод визначення активності кислої фосфатази подібний до методу визначення лужної фосфатази за реакцією із 4-аміноантипірином, але при рН 4,0. У разі присутності активного ферменту досліджуваний продукт набуває забарвлення від світло-рожевого до темно-вишневого. Час проведення дослідження складає 2,5 – 3 години.

Вас також може зацікавити