Очищення канабіноїдів методом рідинної хроматографії: аналітичний і препаративний підходи

Цей матеріал створено виключно з науково-дослідною метою, а описане в ньому обладнання призначене для використання в сертифікованих випробувальних лабораторіях на території України відповідно до чинних вимог українського законодавства.

Поступова декриміналізація канабісу для медичних і рекреаційних цілей суттєво підвищила інтерес до його хімічного складу, насамперед до канабіноїдів, які активно досліджуються завдяки потенційним знеболювальним, протизапальним і протитривожним властивостям.

Водночас очищення канабіноїдів із рослинної сировини, паст або олій залишається непростим технологічним завданням. Причина – складна матриця екстрактів, що містить терпени, воски, пігменти й інші супутні компоненти. Додаткову складність створює подібність хімічних структур і фізико-хімічних властивостей самих канабіноїдів, що ускладнює їх селективне розділення.

Саме тому для роботи з такими зразками застосовують високоточні методи, серед яких рідинна хроматографія посідає ключове місце. Вона дає змогу ефективно розділяти, аналізувати й очищувати цільові сполуки з природних субстратів із досягненням високого рівня чистоти.

Аналітична та препаративна високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ)

Рідинна хроматографія може використовуватися як в аналітичному, так і в препаративному масштабі. Кожен підхід має чітко визначене призначення:

• Аналітична ВЕРХ – для якісного й кількісного аналізу компонентів суміші, ідентифікації речовин, визначення їх концентрацій і контролю домішок
• Препаративна ВЕРХ – для фізичного виділення та очищення цільових сполук у необхідній кількості

Обидва підходи є взаємодоповнювальними: розроблення препаративного методу очищення зазвичай починається саме з аналітичного масштабу.

Обладнання KNAUER для роботи з канабіноїдами

Усі рішення, наведені нижче, реалізуються на обладнанні KNAUER – німецького виробника, який із 1962 року спеціалізується на розробленні систем рідинної хроматографії. Компанія базується в Берліні й пропонує широкий спектр рішень: від аналітичних та препаративних ВЕРХ-систем до FPLC, SMB-установок, осмометрів і технологій для виробництва ліпідних наночастинок (LNP).

Аналітична ВЕРХ у контролі продуктів із канабісу

Аналітична ВЕРХ застосовується в різних завданнях, пов’язаних із контролем продуктів з канабісу, і допомагає фахівцям усіх сегментів ринку. Для отримання безпечного продукту найвищої якості необхідно провести низку лабораторних тестів. До них належать:

• Визначення вмісту активних речовин шляхом кількісного аналізу ТГК (наявність / відсутність ТГК)
• Виявлення природних домішок, зокрема мікотоксинів
• Визначення штучних домішок, як-от пестициди

Схема потоку для AZURA Cannabis Profiler

Приклад аналітичного рішення

Спеціалізовані системи, такі як AZURA Cannabis Profiler, допомагають:

• Визначати шість основних канабіноїдів за 15 хвилин відповідно до вимог DAB / Ph. Eur.
• Виконувати детальний аналіз із високою роздільною здатністю до 15 канабіноїдів за 20 хвилин 

Кількісне визначення шести канабіноїдів за 15 хвилин відповідно до вимог DAB / Ph. Eur. 

Детальний аналіз 15 основних канабіноїдів за 20 хвилин

Нижче наведено приклад переліку компонентів, які можуть бути розділені в рамках такого аналізу.

Типовий перелік визначуваних сполук

Препаративна хроматографія для очищення канабіноїдів

У випадках, коли необхідно отримати високоочищені канабіноїди з рослин канабісу або сирих екстрактів, препаративна хроматографія є найбільш універсальним методом.

Розроблення препаративного методу

Оптимальний підхід передбачає поетапне розроблення методу:

1.    Аналітичний етап

Розроблення препаративного методу спершу проводиться в аналітичному масштабі. На цьому етапі отримують початкову хроматографічну інформацію про зразок із використанням первинного градієнта.

2.    Оптимізація розділення

Після первинного аналізу оптимізується роздільна здатність у зоні цільової сполуки. Для цього застосовується фокусний градієнт із пологим нахилом, який дозволяє досягти кращого розділення компонентів.

3.    Дослідження перевантаження

На наступному етапі проводиться дослідження перевантаження за об’ємом та/або масою. Це необхідно для визначення максимального навантаження на колонку перед переходом до препаративного масштабу.

4.    Масштабування методу

Масштабування хроматографічного розділення потребує високої точності розрахунків. У разі помилок кінцевий результат не забезпечить тієї ж роздільної здатності, що була досягнута в аналітичному масштабі. Загалом масштабування є складним процесом через велику кількість взаємопов’язаних змінних.

Лінійне масштабування

Найпростішим варіантом масштабування є лінійне масштабування, яке здійснюється з використанням колонок:

• З однаковою нерухомою фазою
• Однакової довжини
• З однаковим розміром частинок
• З різним внутрішнім діаметром

Схема потоку для AZURA Cannabis Purifier

На відміну від аналітичної, метою препаративної хроматографії є збір піків або ділянок хроматографічного прогону, що становлять інтерес. Після виявлення детектором аналіт збирається колектором фракцій. Через це детектори, що використовуються, повинні бути недеструктивними або система має бути оснащена сплітером потоку. Чутливість детектора при цьому не відіграє ключової ролі порівняно з аналітичною хроматографією, оскільки його інформація використовується для поділу фракцій, а не для кількісного аналізу.

Однією з основних переваг препаративної хроматографії є можливість масштабування процесу очищення від мікро- чи міліграмових кількостей до грамів і навіть кілограмів. Крім того, у препаративній хроматографії застосовується максимально можлива концентрація та об’єм ін’єкції, що допомагає зменшити кількість ін’єкцій, скоротити витрати рухомої фази й знизити обсяг утворених відходів розчинника. Ще одна практична перевага – можливість повторного очищення або аналізу зразка в разі невдалого експерименту з першої спроби.

Очищення канабідіолу (CBD) з CBD-олії

Ефект очищення підтверджується порівнянням хроматограм до й після препаративного розділення.

Хроматограма зразка до очищення

Хроматограма зразка після очищення

Позначення піків (приклад)

Хроматограми аналізу до (−) і після (−) очищення

1 – канабігерол (CBG)

2 – канабідіол (CBD)

3 – Δ⁹ -тетрагідроканабінолова кислота (Δ⁹-THCA)

Рішення KNAUER в Україні

В Україні офіційним дистриб’ютором рідинних хроматографів AZURA бренду KNAUER є ТОВ «Хімлаборреактив». Компанія постачає обладнання, забезпечує інсталювання, методичну підтримку й сервісний супровід на всіх етапах упровадження. Фахівці ХЛР допоможуть підібрати оптимальне рішення для задач аналізу й очищення канабіноїдів з урахуванням типу зразків, регуляторних вимог і виробничих масштабів.

Анастасія Рябченко,

продакт-спеціаліст Відділу аналітичного обладнання ХЛР